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(1)外显子生物实验室提供: Pull down RNA探针标记服务;价格:3500元,10-20T,备注:小于2000bp。

(2)提供:RNA标记生物素,以便于开展Pull down实验。

(3)标记原理:通过T3、T7转录获得互补的RNA,然后,进行3端标记,将生物素标记在RNA上;

(4)获得的RNA探针,用于Pown down实验。

附说明书:


磁珠法RNA-Protein Pull-Down 试剂盒(V5.3

货号:R5126    本试剂盒室温运输,储存于4°C

试剂盒成份:

(一)蛋白-RNA富集试剂盒(25TR5126-1,储存于4°C

1Streptavidin 磁珠:1mL, 10mg/mL

2RNA捕获溶液:10mL, 20mM Tris pH 7.5, 1M NaCl, 1mM EDTA

320mM Tris, 5mL, pH 7.5

4)蛋白-RNA结合溶液(10X)1mL,0.2M Tris pH 7.5, 0.5M NaCl, 20mM MgCl2, 1% Tween-20

5)洗液(1X), 10mL, 20mM Tris (pH 7.5), 10mM NaCl, 0.1% Tween-20

6Biotin Elution Buffer, 1.5mL

750%无菌甘油, 0.5mL

8HuR Monoclonal Antibody, 50μL, For Western blots10T

(二)探针对照:R5126-2储存于-20°C

Positive AR RNA Probe10μM 25μL, 5Test

5´-CUGGGCUUUUUUUUUCUCUUUCUCUCCUUUCUUUUUCUUCUUCCCUCCCUA-3´

Negative RNA (A)25 Probe25μL, 5Test

试剂盒介绍:

磁珠法RNA-蛋白质沉淀试剂盒,利用链霉亲和素磁珠链接到生物素标记的RNA,形成磁珠探针,生物素标记的RNA探针与目的蛋白(RBP)结合。磁珠-亲和素-生物素化RNA与蛋白形成复合物。通过磁珠分离出来。该试剂盒包括:各种缓冲液,标记生物的阳性对照、阴性对照,适合下游检测如蛋白质印迹(WB)和质谱(MS)。
对照原理:阳性RNA对照系统:利用3'非翻译区雄激素受体(ARRNAAR RNA的近端3´非翻译区(UTR)包含HuRPolyC)结合蛋白(CP1CP2)的UC富集区。这些RNA结合蛋白调节mRNA稳定性,一般细胞都应该呈现阳性。阴性对照polyA25 RNA和哺乳动物细胞裂解液mRNA不结合,也不包含HuRpolyCBP结合位点。

 

简略步骤

本试剂盒的蛋白的富集程序已经过优化,步骤原理下图。首先将生物素标记的RNA结合到磁珠上,以使生物素的RNA定向结合特异性蛋白质。亲和素的磁珠与生物素的RNA结合。将结合RNA的磁珠在蛋白质-RNA结合缓冲液中平衡。通过添加适当的缓冲液,涡旋并在磁力架上分离,洗涤磁珠。接着使用SDS-PAGE上样缓冲液洗脱样品,然后进行后续检测。

注意事项-1:准备工作

1)制备目的RNA、纯化,然后自行标记生物素或直接联系我们,外显子生物提供RNA探针的制备和标记,价格280040-50次;
2)金属浴或水浴锅;
3)氯仿:异戊醇(241无水乙醇;
4)细胞裂解液,外显子实验室可提供;
5)洗脱缓冲液:SDS PAGE上样缓冲液;
6)含0.05Tween-20洗涤剂的TBS-T溶液;
71.5ml磁珠分离架,外显子生物实验室有售,250/个;
8)蛋白质印迹用的PVDFHRP山羊抗小鼠IgGH+LWB化学发光底物。

注意事项-2:实验过程

1)生物素RNA作为探针是本实验的关键。
2)操作使用标记的RNA时,请保持无核酸酶的环境。戴上手套,口罩防止RNA酶。
3)不要冷冻或干燥链霉亲和素磁珠,冷冻或干燥会导致珠粒聚集,失去活性。
4)为了减少蛋白质降解,在细胞裂解液制备中加入蛋白酶抑制剂。
5)将SDS-PAGE还原样品缓冲液中的磁珠煮沸时,沸腾使磁珠失去结合活性不能重复使用。

 

详细步骤

第一步 亲和素磁珠的准备
1)保持无核酸酶的条件,用0.1% DEPC溶液喷洒或擦拭清洁工作区域,戴手套,口罩;
2)取出磁珠,旋转10秒,将磁珠重悬,吸取100μl,然后转移至无核酸酶的离心管内。
3)将试管放在磁力架上,磁珠自动保留到试管侧面。用200ul0.1M NaOH50mM NaCl(无核酸酶)洗涤磁珠两次。在100mM NaCl中洗涤一次,溶解平衡磁珠备用。
第二步 裂解细胞(同WB,注意裂解蛋白浓度)
1)将细胞加入裂解液,确保细胞裂解物蛋白,浓度务必大于2.0mg / mL,方便在使用结合反应缓冲液时,保证其影响不大。如果裂解物中盐多,可以透析或者用盐离子洗脱柱。

第三步.标记的RNA与链霉亲和素磁珠结合
1)每50μL磁珠结合100pmol RNA左右,以下说明使用50pmol RNA50μL磁珠。
2)试剂盒包括阳性和阴性RNA对照。为确定用户RNA蛋白结合的特异性,第一次请使用

阳性,阴性对照。
3)在1.5mL微量离心管中加入50μL的链霉亲和素磁珠。放入磁力架中,磁珠靠在试管

的侧面,丢弃上清液。
4)用等体积的20mM TrispH 7.5)洗涤,涡旋重悬珠。重复步骤洗涤一次。
5)于磁力架上,磁珠收集在试管侧面,丢弃上清。加入50uL 1X RNA Capture Buffer
6)将50pmol的标记RNA添加到珠子中,轻轻混合。室温下搅拌孵育15-30分钟。
第四步.RNA结合蛋白与RNA结合
1)将试管放入磁力架中,使磁珠靠在试管的侧面,丢弃上清液。用等体积的20mM TrispH 7.5)洗涤,涡旋重悬珠。
2)重复步骤(1)。
3)将试管放入磁力架中,磁珠靠在试管的侧面,弃上清液。将10XRNA-蛋白质结合缓冲液稀释至1X(即19超纯水稀释)。将100μL 1X蛋白质-RNA结合缓冲液添加到磁珠混合。

4准备RNA-蛋白质结合反应的预混液:
10X
蛋白质-RNA结合缓冲液      10       5-20微升
50
%甘油                      30       0-50微升
其他盐等(可变)               X       体积
裂解液(蛋白质浓度2mg / mL     1-30    20-200微克
无核酸酶的水                 100    100μL
5)将试管放入磁力架中,以将磁珠收集在侧面,丢弃上清液。
6)将100μL的预混液添加到结合
RNA的磁珠中,通过移液器或轻轻涡旋混合。
7)在4°C下搅拌或旋转孵育60分钟。
第五步. RNA结合蛋白复合物的洗涤和洗脱
1)将试管放入磁力架中,使磁珠靠在试管的侧面。将上清液转移到试管中以备后用。
2)用等体积的1X洗涤缓冲液(100μL)洗涤。
3)再重复两次步骤12。如果需要,请保存洗涤上清液以进行分析。
4)将试管放入磁力架中,使珠子靠在试管的侧面。将上清液转移到试管中以备后用。
5)向珠中加入50μL洗脱缓冲液,并涡旋混合均匀。于37°C搅拌孵育15-30分钟。
6)将试管放入磁力架中,以将磁珠收集在试管侧面。除去上清液用于下游分析。
7)如果下游应用是蛋白质印迹,将原样品缓冲液添加至样品至1X
9)在95-100°C下加热洗脱的样品5-10分钟。电泳凝胶上或在-20°C储存直至使用。
10)对于对照反应,每泳道加30μL

第六步.蛋白质印迹分析
注意:细胞裂解物泳道作为对照,以验证蛋白质印迹是否正常运行。
1.
通过SDS-PAGE分离蛋白质,并转移到硝酸纤维素膜上。
2.
在室温下,将膜在含有5%牛血清白蛋白(BSA)的TBS-T中封闭1小时。
3.
准备在10mL5BSATBS-T中包含10μLHuR抗体(36kDa)的溶液。
4.
在室温下将膜在抗HuR抗体中孵育4小时,或在4°C过夜。
5.
TBS-T清洗膜5次,每次5分钟。
6.
将山羊抗小鼠IgGH + L)(HRP共轭,120,000)稀释到含有5BSATBS-T中。
7.
将膜在稀释的山羊抗小鼠IgG中于室温孵育1小时。
8.
TBS-T清洗膜5次,每次5分钟。
9.
将膜与化学发光底物在室温下孵育(例如,SuperSignal West Pico化学发光底物)。
10.
立即将胶片暴露在X射线胶片或CCD相机上进行适当的曝光。





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