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EB病毒原位杂交检测试剂盒
作者: 发布于:2019/5/3 9:12:29 点击量:

EB病毒原位杂交检测试剂盒

一、试剂盒介绍:货号:EB-1803

试剂1

玻片处理液A

50毫升

试剂2

生物素标记的EB探针杂交液

5毫升

试剂3

HRP标记的抗生物素抗体溶液

5毫升

试剂4A

DAB显色液A

0.5毫升

试剂4B

DAB显色液B

0.5毫升

试剂5

蛋白酶K缓冲液

50毫升

试剂6

PBS缓冲液

1000毫升×2

试剂7

2xSSC缓冲液

1000毫升×4

试剂8

苏木素染液

50毫升










1)检测原理:

EB病毒属DNA类的疱疹科病毒,能特异性嗜淋巴细胞。通过接触传播,将侵入鼻咽部的淋巴样组织或其他肿瘤组织内部。主要侵犯的是B淋巴细胞。EB病毒在自然界广泛存在,与鼻咽癌发病密切相关、还肠道肿瘤以及传染性单核细胞增多症有关,此外还和淋巴瘤发病密切相关,如霍奇金淋巴瘤,Burkitt淋巴瘤等、慢性疲劳综合征、器官移植等。

EBEREB病毒编码的小RNA,在EB病毒感染的细胞核内出现。对EBER进行克隆、合成标记的EBER RNA探针,可用于冰冻切片、石蜡切片、细胞涂片、细胞爬片,具有较高的特异性和灵敏度。


2)试剂盒特点:

本试剂盒采用生物素标记探针,辣根过氧化物酶系统DAB显色剂,敏感性强;蛋白酶K消化,稳定可靠;37杂交即可;常温PBS洗涤;一步检测。

3)试剂盒成份:

 

4)保存条件

Ø  所有试剂2-6℃保存;

Ø  试剂盒在有效期内的稳定;

Ø  不要使用已经过期的试剂;

Ø  用前,将所有的试剂恢复至室温(20-25℃),探针溶液必须混匀;

Ø  应带手套操作,使用新鲜二甲苯及乙醇溶液。

二、     检测预准备

l  DAB显色液:将试剂4A4BPBS按体积比1:1:18的比例混合,按实际需要量配制,即配即用。

l  PBS配制:将一袋PBS粉末溶于1000毫升双蒸水,彻底溶解,混匀后使用。

l  SSC缓冲液:将一袋SSC粉末溶于1000毫升双蒸水,溶解,混匀后使用。

三、 检测步骤

1.   烤片:将组织切片置于烤箱或加热板,在85℃的温度下加热20分钟。.

2.   脱蜡:把加热后的组织切片浸泡在二甲苯溶液中,五分钟一次,总计三次。再将组织切片依次放入梯度乙醇100%85%75%中,每次3分钟。用蒸馏水洗涤2分钟。

3.   再用,3%的双氧水浸泡组织切片15-25分钟,用蒸馏水洗涤2分钟。

4.   在组织切片或细胞上滴加200-300μl 玻片处理液,在常温下浸泡20分钟,用PBS洗涤5分钟。

5.   每一个载玻片上滴加200-300μl 蛋白酶K缓冲液,使之覆盖细胞,放入湿盒中,在37℃的干燥箱中培养15分钟,用PBS洗涤3次,每次5分钟。

6.   每一个组织切片上滴加30-50μl的含有生物素标记的EB探针的杂交液,盖上盖玻片,在95℃的加热板上加热5min,再放入湿盒中,在37℃的干燥箱中放置至少16h

7.   取出湿盒中的组织切片,用2xSSC溶液洗涤15 min

8.   在组织切片中加入30-50μl/片的HRP标记的抗生物素抗体的溶液,常温下孵育1小时,用2xSSC洗涤15分钟。

9.   加适量配制好的DAB显色液,显色5-15分钟,注意光镜下观察显色情况。用蒸馏水冲洗1分钟。

10. 滴加适量苏木素复染,染色约1min,用蒸馏水或去离子水短时间冲洗,浸泡PBS 10分钟返蓝。

11. 封片:依次放入梯度乙醇溶液(75%85%100%)中各3min,再放入二甲苯溶液中,10分钟。滴加中性树脂,盖盖玻片,常温保存。两年内不褪色。

四、 结果评判:

1)阳性结果出现在细胞核上,颜色显示深棕色或浅棕色,与EB含量有关,阴性结果是核上无棕色。

2)细胞浆,红细胞染色是非特异的,因为部分血液细胞、红细胞、内分泌细胞存在内源性酶或生物素。

 




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